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突破腺相关病毒载体包装容量限制的策略(上)

腺相关病毒(A deno2A ssociated V irus) 为非致病性单链DNA 微小病毒, 野生型病毒仅仅在腺病喷泉毒等辅助病毒存在的情况下才会感染人体, 对人体组织, 特别是肝、脾等有很强的亲嗜性, 可感染分裂和非分裂细胞, 并定点整合到19 号染色体。砂岩重组腺相关病毒(rAAV ) 载体虽然丧失了定点整合的特性, 但是腺相关病毒转导的以附着体(Ep isome) 形式存在的目的基因仍可在细胞内长期持续稳定表达。由于腺相关病毒有以上一些优点, 因此被广泛应用于基因治疗的研究中, 并且在某些遗传性疾病如血友病B 临床试验中已经取得了非常好的效果。但是由于重组腺相关病毒载体包装容量较小, 最大不能超过5kb,因此限制了它在缺陷基因较大的遗传性疾病如血友病A、囊性纤维化、遗传性肌营养不良中的应用。如何利用腺相关的生物学特性与相关遗传缺陷的蛋白和基因的特点突破腺相关病毒载体包装容量限制, 是扩大重组腺相关病毒载体在遗传性疾病基因治疗中应用的重要环节。目前所采取的研究策略主要有以下几个方面: ①通过删除目的基因中部分与正常生理功能关系不大的DNA序列, 缩短基因, 并选用较小的基因调控元件, 包括启动子、增强子和多聚腺苷酸信号等使目的基因的表达盒缩小。②腺相关病毒感染某些脏器时, 可能对某些细胞具有特别的亲嗜性。如Synder 1 等人将4. 8×1010 rAAV 2hF IX载体注射到小鼠体内后, 只有5% 的肝脏细胞有基因表达的证据, 在应用不同的rAAV 载体进行的共转染实验中,发现30%～ 40% 的除元器件产生的1系列问题外肝脏细胞可以被两种载体共转染, 因此可以将组成蛋白的不同亚基分别表达于不同的载体,然后在宿主细胞内重新组装出具有活性的完整蛋白; 或利用腺相关病毒在细胞内形成多聚体的特点, 将目的基因或调控元件分别置于不同的载体上, 在共转染细胞中高效表达目的基因; 或是使分别表达的基因片段具有部分重叠, 然后在体内通过同源重组, 达到表达完整基因的目的。

缩小目的基因表达盒

某些遗传性疾病的缺陷基因, 如凝血因子D (FV ? ) ,Duchenne 肌萎缩基因等cDNA 全长均超过5kb, 前者为9kb, 后者更长达14kb。但是在这些基因中, 有些序列编码区并不是蛋白功能所必须的, 如FV ? 基因中的B 区, 在基因表达后即被剪切, 对正常因子D 功能的发挥并没有贡献, 而且B 区的存在也抑制了因子D 的表达。因此, 通过基因重组删去这些序列可缩短目的基因片段, 在B 区去除后可获得仅长4. 4kb 左右的因子D cDNA , 其表达的因子D 功能与生理情况下合成的因子D 相同, 而且表达效率提高2 。

但是, 即使是经过基因改造是部分目的基因的长度有了一定程度的缩小, 但相对rAAV 的包装容量来说仍然显得太大。将4. 4kb B 区缺失的因子D cDNA 插入rAAV 载体后, 仅剩500bp 左右的空间来放置基因表达调控元件, 因此只能够选择配件较小的启动子、增强子等。但是由于这些启动子往往强度较弱, 难以获得较为理想的表达水平。Gnatenko DV 3 等人将B 区缺失的因子D cDNA置于长243bp 的人类小核RNA 启动子(pHU 121) 之下,在体外真核表达质粒中获得的表达水平为巨细胞病毒(CMV ) 启动子驱动的因子D 表达水平的30% , 将该表达框架克隆入rAAV 载体中(感染指数MO I, 35) 并转染CO S21 细胞(2 ×105, 48h ) , 仅获得了微量水平的表达(15mU?m l?1 ×106 细胞)。作者认为rAAV 制备困难而导致MO I 水平过低可能是导致因子D 水平表达不佳的主要原因, 但是并不能排除由于表达盒的组成而妨碍rAAV包装的可能。Chao H 4 等选取单纯疱疹胸腺嘧啶激酶(Tk) 启动子和乙肝病毒增强子I(均120bp 左右) 并采用无辅助腺病毒制备方法构建了高滴度的因子D rAAV 载体(MO I= 10) , 在体外转染293 细胞(1×106) 获得了较高水平的表达(72 mU?m l?1 ×106 细胞, 24h) , 将该rAAV载体(2×1011 ) 经肝门注射后, 在SC ID 小鼠中获得了40ng?m l 的表达, 但是这一表达水平与其他载体, 如无肠腺病毒载体所获得的因子D 表达水平相比光连接器, 仍然偏低, 而且考虑到人跟鼠之间的体积差异, 这一表达水平仍然是不能令人满意的。

在不同的rAAV 载体上分别表达目的蛋白的不同亚基

某些目的基因蛋白可能由数个不能的功能亚基组成, 而不同的功能亚基之间可能可以独立的表达, 而后通过二硫键等结构互相连接, 从而组成具有活性的完整蛋白。凝血因子D 基因在转录翻译后, 在粗面内质中被剪切成为两条独立的肽链(重链与轻链) , 在由粗面内质经高尔基体、细胞膜向细胞外分泌的过程中, 重链和轻链通过二硫键重新组合在一起, 血管性血友病因子(VW F)可以促进这一过程的进行。将含有编码因子D 重链与轻4 3 5 陕西医学杂志2004 年6 月第33 卷第6 期链的基因片段的真核表达载体共转染细胞后, 所获得因子D 表达水平高于含完整因子D 基因或B 区缺失的因子D 基因表达质粒所表达的因子D 水平5 。

Burton M 6 等将因子D 轻、重链基因分别表达于两个rAAV 载体中(3×1011) , 经肝门注射到C57BL 小鼠体内后, 可获得最高达230～ 430ng?m l 的因子D 表达, 表达时间持续超过1 年。但是, 轻、重链的表达存在着明显的不平衡, 具有活性的因子D 水平仅为用轻链抗体测定的因子D 水平的5%～ 10%。随着“大众创业万众创新”的逐渐深入这一现象产生的原因可能与因子D 重链上的A 2 结构域存在与免疫球蛋白结合蛋白(B IP) 的结合位点, 从而限制了重链及完整因子D 的表达有关。由于血浆中游离轻链表达过高, 可能诱发比较严重的免疫反应, 从而限制了这种研究方案的进一步实施。通过对轻、重链采用强度不同的启动子, 使轻链水平下降, 从而达到二者表达的平衡或许是解决这一问题的措施之一, 但是也许通过在重链载体中串联表达针对B IP基因mRNA 的特异性干扰RNA ( shRNA ) 的表达盒, 可能会通过抑制B IP 表达提升重链水平而达到同样的目的。另外, 在引起血友病A 的因子D 突变中, 有些错义突变, 可能会使因子D 保留一条功能正常的重链或轻链(在17 号外显子基因敲除的血友病A 小鼠模型中就有重链存在, 虽然其是否具有功能还难以肯定7 ) , 对这样一些病人仅给予表达重链或为其他工业领域提供新的发展机会轻链的rAAV 载体可能会获得同样良好的效果。对此问题还需进行大量的临床分子流行病学的调查, 以证实有多少病人可能存在这种现象, 同时还需要对因子D 合成与分泌的生理进行更深入的研究, 以获悉诸如因子D 轻、重链结合位点, 异常轻链或重链是否会对导入基因的表达和结合产生显性负作用等信息。

(待续)